Этапы программы ЭКО, ЭКО+ИКСИ

Оплодотворение яйцеклеток в "пробирке" (in vitro) (ЭКО)

В течение 4 часов зрелые яйцеклетки инкубируются в термостате, проходя так называемую, стадию адаптации, во время которой они привыкают к условиям in vitro (вне организма). Часть яйцеклеток завершает этап созревания в присутствии клеток cumulus (клетки яйценосного бугорка) и corona radiate (клетки лучистого венца), поставляющих в ооплазму РНК и белки, необходимые для дозревания.

Способность сперматозоида к оплодотворению появляется лишь после капацитации, под которой понимается весь комплекс биохимических и ультраструктурных изменений, происходящих в сперматозоиде до встречи с ооцитом in vivo ( в организме). Эти изменения затрагивают в основном головку сперматозоида. Капацитация in vitro происходит во время обработки спермы в средах, содержащих альбумин. Для нормального оплодотворения in vitro (вне организма) необходимо 50-100 тыс. таких сперматозоидов, что во много раз превышает количество сперматозоидов, необходимых для оплодотворения яйцеклетки в маточной трубе. Такое большое количество объяснятся недостаточной физиологичностью среды, а также большим размером массы cumulus у яйцеклеток, получаемых при трансвагинальной пункции яичников. Прежде чем попасть в яйцеклетку, сперматозоид преодолевает несколько барьеров. Это cumulus, представляющий собой растянутый матрикс, состоящий из полигиалуроновой кислоты с редко расположенными клетками. Преодолеть этот барьер может только капацитированный (подготовленный ) сперматозоид с интактной акросомой. По мере продвижения внутрь cumulus поведение сперматозоида изменяется, резко возрастает скорость - наступает фаза гиперактивности. После прохождения cumulus сперматозоид достигает zona pellucida, где происходит его связывание с рецепторами. Затем происходит акросомная реакция - мембрана акросомы сперматозоида и цитоплазматическая мембрана яйцеклетки сливаются, содержимое акросомы выбрасывается в месте связывания с zona pellucida и сперматозоид интенсивно продвигается сквозь оболочку ооцита. Связывание сперматозоида с рецепторами на плазматической мембране мгновенно вызывают кортикальную реакцию - массовый экзоцитоз гранул, находящихся по периферии яйцеклетки, что приводит к необратимым изменениям zona pellucida, делающим ее непроходимой для остальных сперматозоидов. Далее начинается процесс слияния мембран сперматозоида и яйцеклетки. Сразу после слияния гамет ядерная мембрана сперматозоида разрушается, хроматин деконденсируется под влиянием факторов ооплазмы. Яйцеклетка (ооцит) также активируется, мейоз возобновляется, выделяется второе полярное тельце. Ядерный материал ооцита окружается оболочкой - формируется женский пронуклеус. Вокруг хроматина сперматозоида формируется мужской пронуклеус. Мужской и женский пронуклеусы начинают движение по направлению друг к другу и после встречи их мембраны начинают разрушаться, и генетический материал обоих гамет сливается. На этом этапе процесс оплодотворения завершается - возникает зигота.

На следующий день после аспирации, ооциты переносят в свежую культуральную среду, очищают от клеток лучистого венца и просматривают на предмет присутствия признаков оплодотворения. Пронуклеусы появляются как правило через 10-16 часов после добавления сперматозоидов в среду с ооцитами и исчезают через 6-8 часов после появления. Если присутствуют оба пронуклеуса - оплодотворение считается нормальным. Если их не удалось обнаружить - оплодотворение не состоялось. Если визуализируются более 2 пронуклеусов - произошло аномальное оплодотворение.

Отсутствие оплодотворения может быть связано с низкой концентрацией активных сперматозоидов, отсутствием рецепторов на zona pellucida и мембране ооцита, незрелостью ооцита, наличием хромосомных аномалий у ооцита.

Полиплоидные зиготы, как правило, возникают при проникновении в ооцит более одного сперматозоида (при избыточном количестве сперматозоидов, при дефектах кортикальной реакции, при незрелости или перезрелости ооцита) или же при неотделении второго полярного тельца после завершения мейоза, генетический материал которого формирует третий пронуклеус.

Оплодотворение яйцеклеток в "пробирке" (in vitro) (ЭКО+ ИКСИ)

Значительный прогресс в лечении мужского бесплодия был связан с внедрением в практику метода интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) для мужчин с тяжелыми формами олиго-, астено-, терато- и даже азооспермии.

В отличие от стандартной процедуры ЭКО, для успеха которой необходимо большое количество сперматозоидов, при ИКСИ в цитоплазму ооцита вводится лишь один сперматозоид, поэтому качество спермы, как правило, не оказывает влияния на частоту оплодотворения и последующего дробления. Более того, ИКСИ можно выполнять, используя сперматозоиды, полученные не только из эякулята, но и из яичка при азооспермии.

Ооцит-кумулюсные комплексы, полученные в ходе пункции фолликулов, инкубируются несколько часов в культуральной среде. Непосредственно перед проведением процедуры ИКСИ ооциты очищают от клеток кумулюса с помощью фермента гиалуронидазы. Этот фермент обладает литическим действием для внеклеточного матрикса, скрепляющего клетки кумулюса. После ферментативной обработки ооциты отмывают в культуральной среде для удаления всех клеток кумулюса. Необходимо оценить степень зрелости ооцитов под микроскопом. Если одно полярное тело отсутствует и в цитоплазме визуализируется ядро - ооцит находится на стадии зародышевого пузырька (germinal vesicle-GV). Если не визуализируется ни ядро, ни полярное тело - ооцит на стадии метафазы 1 деления мейоза (М1). При наличии полярного тела - ооцит окончательно созрел и находится на стадии метафазы 2 деления мейоза (М2) - только на таких ооцитах можно проводить ИКСИ!

Для выполнения ИКСИ необходим инвертированный микроскоп и система микромани-пуляторов. Собственно процедура ИКСИ проводится на чашке Петри, содержащей капли культуральной среды с ооцитами и полосу поливинилпирролидона, замедляющего движение сперматозоидов в 2-3 раза, что позволяет легко манипулировать с ними. Но выбор сперматозоида - непростая задача - следует отобрать прогрессивно-подвижный сперматозоид с нормальной морфологией, оцененной по строгим критериям Крюгера. После отбора сперматозоида необходимо провести его иммобилизацию (обездвиживание), путем неполного перетирания его хвоста о дно чашки с помощью микроиглы. После осуществляется инъекция сперматозоида в ооцит и перенос ооцита в культуральную среду, для дальнейшего культивирования, как после обычного оплодотворения in vitro.